Microscopía y cultivo in vitro

 

Microscopía y cultivo in vitro

Microscopía

Se utiliza en microbiología para dos fines básicos:

1.       Detección inicial del microorganismo.

2.       Identificación preliminar o definitiva

Se utiliza para detectar células bacterianas, elementos fúngicos, parásitos e inclusiones víricas presentes en las células infectadas. Se utilizan 5 métodos microscópicos generales.

 

1.       Microscopia de campo claro.

Los componentes básicos: Fuente de luz que se utiliza para iluminar la muestra colocada en una platina, condensador, dos sistemas de lentes. La muestra se ve mediante transiluminación. Habitualmente se utilizan 3 lentes de objetivos diferentes: bajo aumento (10 veces), alto aumento (40 veces) e inmersión en aceite (100 veces). Los organismos se deben teñir con un colorante para poder observarse.

 

2.       Microscopía de campo oscuro.

Se utiliza n las mismas lentes del objetivo y del ocular que en los microscopios de campo claro, se utiliza un condensador especial que impide que la luz transmitida ilumine directamente la muestra. La capacidad de resolución del microscopio de campo oscuro es significativamente mayor que la de campo claro. La desventaja es que dificulta el estudio de las estructuras internas de los microorganismos.

 

3.       Microscopía de contraste de fases.

Permite examinar los detalles internos de los microorganismos. Se hacen pasar haces de luz paralelos a través de objetos de densidades diferentes. Mediante el uso de anillos anulares en el condensador se amplifican las diferencias de fases. Esto crea una imagen tridimensional del microorganismo.

 

4.       Microscopía fluorescente.

Los fluorocromos absorben la luz UV de longitud de onda corta y emitir energía con una longitud de onda visible y mayor. Supone la tinción de los microorganismos con colorantes fluorescentes, utiliza una lampara de vapor de mercurio, se utilizan una serie de filtros para bloquear el calor, la luz que emite el fluorocromo se amplifica con las lentes del objetivo y de ocular tradicionales.

 

5.       Microscopía electrónico.

Se utilizan bobinas magnéticas para dirigir un haz de electrones desde un filamento de tungsteno a través de una muestra y hacia una pantalla. Se pueden ver partículas víricas individuales. Las muestras habitualmente se tiñen o se recubren de iones metálicos para crear contraste. Hay dos tipos:

·         Microscopios electrónicos de transmisión.

·         Microscopios electrónicos de barrido.

 

 

Métodos de estudio

 

1.       Estudio directo.

La muestra se puede suspender en agua o suero salino (preparación en freso), mezclada con un álcali para disolver el material de fondo (método de hidróxido potásico KOH) o mezclada con una combinación de una combinación de un álcali y un colorante para generar contraste (azul de algodón lactofenol). El método de tinta china, que la tinta oscurece el fondo y no la célula. Se utiliza para detectar cápsulas alrededor de microorganismos.

 

2.       Tinciones diferenciales.

Tinción de Gram es la tinción mejor conocida y más utilizada. Las tinciones de hematoxilina férrica y tricrómica son sumamente útiles para la identificación de parásitos protozoarios. Y la tinción de Wright-Giemsa se utiliza para identificar parásitos sanguíneos.

 

3.       Tinciones acidorresistentes.

El método de Ziehl-Neelsen es el más antiguo, aunque precisa el calentamiento de la muestras durante  el procedimiento de tinción. Existen otros como: la tinción en frio (método de Kinyoun) o por la tinción fluorocrómica (método de auramina-rodamina). El método de fluorocromo es la tinción de elección.

 

4.       Tinciones fluorescentes.

Tinción acidorresistente de auramina-rodamina, se puede utilizar la tinción de naranja de acridina para teñir bacterias y hongos, y el blanco de calcoflúor tiñe la quitina de las paredes de las células fúngicas.

 

 

Cultivo in vitro

 

El éxito de los métodos de cultivo depende de la biología del microorganismo, del lugar de la infección, de la respuesta inmunitaria del paciente frente a esta y de la calidad del medio del cultivo. La mayoría son producidos por empresas con experiencia en su fabricación.

 

Tipos de medios de cultivo

 

Medios de cultivo no selectivos enriquecidos.

A) Agar Sangre: Contienen un medio basal y sangre.

B) Agar Chocolate: Cuando se añade sangre o hemoglobina al medio de base calentado se vuelve marrón.

C) Agar Mueller-Hinton: Incluye extractos de ternera y caseína, sales, cationes, divalentes y almidón soluble necesario para que los resultados sean reproducibles.

D) Caldo tioglicolato: Empleados para recuperar cantidades pequeñas de bacterias aerobias y anaerobias. Los compuestos que se usan son: la caseína, glucosa, extracto de levadura, cisteína y tioglicolato sódico. El suplemento de hemina y vitamina K mejora la recuperación de las bacterias anaerobias.

E) Agar Dextrosa de Sabouraud: Contiene caseína y tejido animal digeridos suplementados con glucosa que se emplea para aislar hongos. Existen diversas fórmulas, aunque la mayoría de los micólogos utilizan la que tiene baja concentración de glucosa y pH neutro.

 

Medios de cultivo selectivos y diferenciales.

A) Agar MacConkey: Selectivo para las bacterias gramnegativos y diferencial para distinguir bacterias que fermentan la lactosa y las que no. Incluye peptonas digeridas, sales biliares, lactosa, rojo neutro y cristal violeta.

B) Agar Sal Manitol: Empleado para el aislamiento de estafilococos. Incluye extractos de caseína y tejidos animales digeridos, extracto de ternera, manitol, sales y rojo fenol.

C) Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XDL): Utilizado en la detección de Salmonella y Shigella. El medio corresponde a un extracto de levaduras con xilosa, lisina, lactosa, sacarosa, desoxicolato sódico, citrato amónico férrico y rojo fenol. Las bacterias que crecen típicamente fermentan la lactosa, la sacarosa o la xilosa y dan lugar a colonias amarillas. Shigella no fermenta estos carbohidratos, de forma que sus colonias serán rojas. Salmonella fermenta la xilosa, pero también descarboxila la lisina y genera el producto alcalino diamino cadaverina.

D) Medio de Lowenstein-Jensen (Lj): Para aislar micobacterias, contiene glicerol, harina de patata, sales y huevos coagulados. Se añade verde malaquita para inhibir las bacterias grampositivos.

E) Agar Middlebrook: Aislar micobacterias. Contiene nutrientes y verde malaquita para inhibir las bacterias grampositivas.

F) CHROMagar: Agares selectivos diferenciales utilizados para aislar e identificar especies distintas de bacterias y levaduras. Contiene cloranfenicol para inhibir las bacterias y una mezcla de sustratos cromogénicas especiales.

G) Agar con inhibidor de hongos filamentosos: Este medio de cultivo es un compuesto selectivo enriquecido que se emplea para el aislamiento de hongos patógenos distintos de los dermatofitos.

 

Cultivo celular

Algunas bacterias y todos los virus son gérmenes intracelulares estrictos, de forma que solo pueden cultivar células vivas. Esta técnica se ha ampliado para poder cultivar la mayoría de los gérmenes intracelulares estrictos.